Levaduras de la fermentación del vino en Canarias
Federico Laich, investigador principal del proyecto «Biodiversidad y dinámica de la población de microorganismos implicados en la elaboración del vino en Canarias» (Instituto Canario de Investigaciones Agrarias) presenta aquí un resumen de actividades en el que se detallan la metodología (tipos de muestras y análisis de las mismas) y algunos resultados. [En PELLAGOFIO nº 2 (2ª época, julio-agosto 2012)].
Por FEDERICO LAICH
En Canarias existe un rico patrimonio en cuanto a variedades de vid, como consecuencia de los intercambios de material mantenido desde hace siglos con otras áreas del mundo
Los estudios microbiológicos realizados en Canarias son escasos, por tal motivo los objetivos propuestos para este proyecto fueron:
1. Identificar y caracterizar los microorganismos (bacterias, levaduras y hongos filamentosos) que están presentes en la superficie de la uva y que intervienen durante la fermentación del vino en las Islas Canarias.
2. Determinar la dinámica de la población de microorganismos durante la fermentación, su interrelación y su posible asociación con las diferentes variedades de vid y zonas ecogeográficas de producción.
3. Crear una colección de cultivos microbianos autóctonos implicados en la fermentación vínica.
4. Identificar los principales microorganismos alterantes del producto.
5. Seleccionar cepas nativas o autóctonas de levaduras y de bacterias del ácido láctico (en caso de considerarse apropiado) adaptadas a las condiciones de vinificación locales que permitan el desarrollo posterior de cultivos iniciadores con una única cepa o mixtos.
Las muestras a analizar fueron obtenidas a partir de dos fuentes diferentes: racimos de uva y mostos en bodegas. Durante el año 2008, el primer tipo de muestras se recolectaron a partir de 18 fincas ubicadas en tres regiones de la isla de Tenerife
1. Origen de las muestras
Las muestras a analizar fueron obtenidas a partir de dos fuentes diferentes; 1) racimos de uva, y 2) mostos en bodegas. Durante el año 2008, el primer tipo de muestras se recolectaron a partir de 18 fincas ubicadas en tres regiones de la isla de Tenerife (zona norte, sur y valle de Güimar) y en tres pisos bioclimáticos diferentes (entre 60 y 1.120 m.s.n.m.). En cada una de las fincas se obtuvieron 10 racimos de cada variedad (Listán Blanco y Listán Negro) en dos estadios fisiológicos diferentes (envero y vendimia). Se determinaron para cada racimo, los grados Brix, el pH, el número de unidades formadoras de colonias (u.f.c.) de levaduras y de bacterias del ácido acético (BAA), y la frecuencia de aislamiento de hongos filamentosos. Se aislaron, de cada racimo, 10 colonias al azar de levaduras y de BAA (en el caso de obtenerlas) y todas las colonias de hongos filamentosos con morfología macroscópica diferente.
En el caso de los racimos obtenidos durante la vendimia, además de las determinaciones descritas anteriormente, se realizaron dos microvinificaciones (200 ml c/u) por cada variedad y finca de origen. Se determinaron los parámetros físico-químicos y se cuantificaron e identificaron las levaduras (20 colonias/microvinificación) y las BAA, al inicio y al final de la fermentación.
Para el segundo tipo de muestras se seleccionaron 15 bodegas que no utilizaran levadura comercial. A partir de cada bodega se recolectaron muestras al principio, mitad y final de fermentación. En cada tiempo de muestreo se aislaron e identificaron 40 colonias de levaduras al azar.
En Lanzarote se seleccionaron ocho fincas ubicadas en la zona de La Geria, Tinajo y Haría distribuidas en dos pisos bioclimáticos, y se muestrearon racimos de las variedades Listán Negro y Malvasía
Durante el año 2009, se repitió el muestreo en la isla de Tenerife (reduciendo a la mitad los sitios de muestreo) y se obtuvieron muestras en las islas de Lanzarote y La Palma. El procesamiento de estas muestras fue similar a lo descrito anteriormente. En Lanzarote se seleccionaron ocho fincas ubicadas en la zona de La Geria, Tinajo y Haría distribuidas en dos pisos bioclimáticos (entre 188 y 390 m.s.n.m.), y se muestrearon racimos de las variedades Listán Negro y Malvasía. Asimismo se obtuvieron muestras a partir de seis bodegas artesanales al principio, mitad y final de fermentación. En La Palma se seleccionaron ocho fincas ubicadas en tres subzonas (Fuencaliente, Mazo y norte) y en cuatro pisos bioclimáticos (entre 365 y 1.180 m.s.n.m.). En este caso se muestrearon racimos de las variedades Listán Negro y Blanco. Asimismo, se recogieron muestras en una bodega ubicada en la zona de Fuencaliente.
2. Identificación y distribución de los microorganismos.
Las actividades desarrolladas hasta la fecha han permitido avanzar en el conocimiento de la distribución de la población de levaduras, bacterias acéticas y hongos filamentosos, en los diferentes pisos bioclimáticos y zonas de producción vitivinícola de Tenerife, La Palma y Lanzarote (objetivos 1 y 2).
La identificación de las levaduras se realizó mediante técnicas de biología molecular. En el caso de Tenerife se identificaron más de 50 especies diferentes
La identificación de las levaduras se realizó mediante técnicas de biología molecular (PCR-ITS-RFLP, secuenciación del fragmento 5,8S-ITS y dominios D1/D2 del ADNr). La diversidad de especies de levaduras en uva (muestras de racimos) fue alta. En el caso de Tenerife se identificaron más de 50 especies diferentes, aislándose con mayor frecuencia Aureobasidium pullulans, seguida por Hanseniaspora uvarum, Cryptococcus(Cr) terrestris, Metschnikowia pulcherrima y Pichia kluyveri. En Lanzarote se identificaron 30 especies diferentes. H. uvarum se aisló de todas las fincas. A. pullulans y Candida zemplinina en el 87,5% de las fincas, y Cr. magnus, Cr. terrestris y P. kluyveri en el 62,5%. M. pulcherrima se detectó solamente en la zona de Haría, en una alta proporción (35,65%). En La Palma se identificaron 35 especies diferentes. A. pullulans y H. uvarum se aislaron en todas las fincas. Cr. terrestris se identificó en todas las fincas de las subzonas Fuencaliente y Mazo, mientras que no se aisló en la subzona Norte. La mayor diversidad de especies se observó a más de 800 m.s.n.m. en la subzona Fuencaliente. En ninguna de las tres islas se aisló Saccharomyces cerevisiae a partir de uva.
En el análisis de las microvinificaciones, se pudo determinar que en Tenerife se aislaron con mayor frecuencia C. zemplinina y S. cerevisiae (principalmente en uva procedente a más de 500 m.s.n.m.). En el caso de las microvinificaciones con uva obtenida a menor altitud se detectaron las siguientes especies; C. zemplinina, C. vanderwaltii, Zygosaccharomyces (Zs) bailii, H.uvarum y S. cerevisiae. En Lanzarote, C. zemplinina fue la especie más abundante, seguida por H. guillermondii, H. uvarum, S. cerevisiae e Issatchenkia orientalis. En La Palma, se detectaron con mayor frecuencia las especies H. uvarum, H. guillermondi, I. orientalis, S. cerevisiae y C. zemplinina.
Para el caso de las bacterias acéticas (BAA), se determinó en las tres islas la distribución espacial de las diferentes especies/genotipos y su relación con los diferentes bioclimas y variedades de uvas. A partir de las muestras de racimos no se detectaron BAA. Sin embargo, a partir de las microvinificaciones se identificaron 396 aislamientos a través de la secuenciación del gen 16S del ADNr. La identificación y caracterización genotípica de estos aislados se realizó en colaboración con el Dr. Albert Más de la Facultad de Enología de Tarragona (Universitat Rovira i Virgili).
En Tenerife todos los aislados pertenecieron al género Acetobacter (A. tropicalis, A. malorum, A. cerevisiae y A. pasteurianus) y Gluconacetobacter (G. saccharivorans). La especie más abundante fue A. malorum y la menos abundante G. saccharivorans. En Lanzarote y La Palma no se detectó la especie G. saccharivorans y, además del género Acetobacter antes mencionadas, también se identificaron aislamientos de Gluconobacter japonicus.
Para analizar la diversidad genotípica se emplearon las técnicas de tipificación ERIC-PCR y (GTG)5-rep-PCR. Se recuperaron 61 patrones diferentes entre los aislados de todas las islas. La biodiversidad encontrada en las tres islas fue alta, siendo en Tenerife la mayor. En esta isla se detectaron un total de 40 genotipos y 10 de ellos estaban presentes en más de un viñedo. En La Palma, de los 17 genotipos encontrados tres de ellos aparecieron en dos viñedos. En Lanzarote se identificaron 4 genotipos y cada uno de ellos correspondió a una especie distinta y apareció en un solo viñedo.
Con respecto a los hongos filamentosos, ‘Penicillium’ fue el género que se aisló con mayor frecuencia en las tres islas. ‘Aspergillus’ se detectó principalmente en las fincas ubicadas en zonas más cálidas y secas (menor altitud)
Con respecto a los hongos filamentosos, Penicillium fue el género que se aisló con mayor frecuencia en las tres islas. Aspergillus se detectó principalmente en las fincas ubicadas en zonas más cálidas y secas (menor altitud). A través de la secuenciación del gen de la beta-tubulina, se identificaron cinco especies de Aspergillus; A. carbonarius, A. fumigatus, A. tubingensis, A. niger y A. flavus. El 87,5% de los aislados de A. carbonarius fueron productores de Ocratoxina A (OTA) en medio de cultivo (objetivo 4). No se detectó OTA en ninguno de los aislados del resto de las especies de Aspergillus. Asimismo, se identificaron aislamientos de los géneros Curvularia, Hyphopichia, Rhizopus, Neosartoya, Cunninghamella, Botrytis, Phoma, Trichotecium, Fusarium, Trichoderma, Ulocladium, Alternaria, Cladosporium, Stemphylium y Mucor. La distribución de las diferentes especies fúngicas parece asociarse principalmente con la temperatura, siendo los ambientes más cálidos los que aumentan la proporción de especies del género Aspergillus.
Todos los aislados de levaduras, BAA y hongos filamentosos fueron conservados en un crioprotector a -20ºC (objetivo 3). En el caso de las BAA esta colección se conserva por duplicado en el Laboratorio de Microbiología Aplicada del ICIA y en el Departamento de Bioquímica y Biotecnología de la Facultad de Enología de Tarragona (Universitat Rovira i Virgili). En el caso de las levaduras identificadas como posibles especies nuevas, se están depositando en la CECT y en la CBS. Estas levaduras se están analizando morfológica, fisiológica y filogenéticamente con la finalidad de realizar la respectiva publicación y propuesta de una especie nueva.
3. Selección de cepas autóctonas de Saccharomyces cerevisiae
Con respecto a la selección de cepas de S. cerevisiae nativas (objetivo 5) se identificaron, por PCR-ITS-RFLP, 600 aislados de S. cerevisiae obtenidos a partir de las muestras de bodegas de Tenerife. Cada uno de estos aislados fue caracterizado genotipicamente a través de la amplificación de los elementos delta (cebadores delta-12 y delta-21), detectándose 250 genotipos diferentes. El mismo procedimiento se realizó con los aislados de S. cerevisiae obtenidos a partir de las microvinificaciones (muestras de uva de Tenerife). En este caso se detectaron 200 genotipos sobre un total de 900 aislados. Estas cepas (450 genotipos en total) se utilizaron para comenzar con un exhaustivo proceso de selección de levaduras autóctonas con buena aptitud enológica.
Este trabajo se realizó en colaboración con la Dra. Sara González de Bodegas Insulares de Tenerife S. A. (a través de un convenio de investigación). Se preseleccionaron 10 cepas mediante pruebas a pequeña escala, a través de la evaluación de las siguientes características: 1) Capacidad competitiva, 2) Dinámica de la fermentación, 3) Capacidad de fermentación a diferentes temperaturas, 4) Fermentación con altas cantidades de azúcares: tolerancia a un grado alcohólico alto, 5) Resistencia a altas concentraciones de metabisulfito, 6) Capacidad fermentativa a bajos niveles de nitrógeno asimilable, y 7) Características organolépticas. Durante la vendimia del 2010, estas levaduras fueron probadas en cinco bodegas de Tenerife y en dos variedades de uva (Listán Blanco y Negro).
Durante la vendimia del 2011 se probaron en tres bodegas y a escala industrial (2.000 a 10.000 litros), las dos cepas de levaduras que presentaron los mejores resultados en la vendimia anterior
Durante el proceso fermentativo se determinaron los parámetros físico-químicos y la evolución de las cepas inoculadas a través de un “fingerprinting” del ADN. Posteriormente, se realizó una cata (formado por un panel de catadores y enólogos) de los vinos obtenidos y se determinaron los ésteres y alcoholes superiores por cromatografía de gases. Durante la vendimia del 2011 se probaron en tres bodegas y a escala industrial (2.000 a 10.000 litros), las dos cepas que presentaron los mejores resultados en la vendimia anterior. Se realizaron las determinaciones físico-químicas correspondientes y se analizó la dinámica poblacional de las cepas inoculadas. Los resultados obtenidos fueron satisfactorios y estos aislados serán depositados en la CECT como microorganismos con propósitos de procedimientos de patentes bajo la regulación del Tratado de Budapest.
